Tip:
Highlight text to annotate it
X
Välkommen till Novus Visual Protocol serien.
I den här videon kommer vi att lära dig att utföra alla faser av en Western Blot använder
vanligaste metoderna för denna analys.
Innan vi kan börja förbereda blot måste vi först förbereda vårt urval lysat.
I det här exemplet kommer vi att förbereda ett protein lysat från odlade celler.
Här
vi tvätta cellerna två gånger med iskall PBS
och tillräckligt lysbuffert för att täcka cellerna.
Valet av lysbuffert beror till stor del på
val av proteinet av intresse.
Vi skrapa cellerna och överför cellen lösningen på ett centrifugrör
placerades på is.
För att lösa membranbundna proteiner, kommer vi att kräva starkare
extraktion detergenter jämfört med isolerade cytoplasmatiska proteiner.
I detta exempel
vi använder en vanlig RIPA buffert,
vilket är en vanlig buffert för att erhålla maximal proteinutbyte. Medan utvinna
proteiner från alla cellulära lokaliseringarna,
är det mycket viktigt att inkludera proteashämmare i din lyseringsbuffert som kommer
förhindra nedbrytning av ditt prov. Använd alltid nyberedd proteas
hämmare, hålla prover på is och arbeta snabbt.
Vi löss cellerna genom att pipettera upp och ned
följt av inkubation på is under 30 minuter.
Centrifugera sedan cellerna till en pellet.
Kassera pelleten och samla upp supernatanten. Det här är din lysat.
Bestäm den totala koncentrationen av ditt protein lysat genom
testa en liten del av din lysat
med en kommersiellt tillgänglig protein kvantifiering analys
såsom BCA.
Detta kommer att hjälpa dig att ladda lika mängder protein i din gel.
Western blöts typiskt förformas under reducerat och denaturerat
förhållanden. Dessa villkor gör det möjligt proteiner som separata av deras
molekylvikt
snarare än deras infödda konformations form eller laddning.
Att reducera och denaturera prover,
späd varje i en laddningsbuffert såsom traditionella Laemmli buffert.
Denna buffert innehåller beta-merkaptoetanol, eller DTT, för att minska disulfid åsar
mellan cysteiner,
SDS för att hjälpa denaturering en negativ protein,
glycerol för att tillåta proverna att sjunka i varje brunn,
bromfenolblått att visualisera lysatet och en ikonisk buffert.
Votex varje prov vid 95 grader Celsius under fem minuter till
helt denaturera proteinerna. Du är nu redo att ladda dina prover
i en SDS-PAGE-gel.
För detta nästa steg kommer vi att separera de enskilda proteiner i vårt urval
lysatet
baserat på deras molekylvikt
med hjälp av en positiv elektrod att attrahera en negativt laddad protein.
För att göra detta
vi ladda vår tidigare framställda proteinprover till en kommersiellt tillgänglig
polyakrylamidgel.
Geler finns i fasta procentsatser eller gradienter av akrylamid.
Ju högre akrylamid desto mindre andel av gel
procentsats.
Därför högre procentuella gel är bättre för låg vikt proteiner, låg andel
geler är bättre för stora vikt proteiner och geler lutning kan användas för
proteiner av alla storlekar
på grund av deras varierande intervall i porstorlek.
Förbered din gel genom att sätta in det i elektroforesapparaten och
fyllning med rinnande buffert som är lämplig för din gel kemi.
Skölj brunnarna i gelén med rinnande buffert och tillsätt buffert till
kammare.
Ladda dina prover in i brunnarna.
Om du är osäker på hur mycket att ladda,
10-30 mikrogram totalt protein är ett förslag startpunkt
liksom hela beloppet prov laddad.
Du kommer också att behöva reservera minst en bra för förfärgade molekylvikt
stege.
Stegen kan du övervaka proteinseparation under
elektrofores och därefter kontrollera protein vikt i ditt prov under
senare analys.
Stäng elektroforesenheten och anslut den till en strömkälla. De flesta enheter
vanligtvis kör 45-60 minuter vid 200 volt
eller tills laddningsbufferten når botten av gelén.
Under denna tid de negativt laddade proteinerna i varje prov migrerar mot
den positivt laddade elektroden gör sin väg genom polyakrylamid
gelmatris.
I nästa steg kommer vi att överföra våra separera proteiner från gel
och in i ett fast membran eller blöt.
Detta är baserat på samma princip som det tidigare steget
i vilken ett elektriskt fält belastar avlägsna de negativa proteinerna
mot en positiv elektrod.
Överlåtelse kan ske under våta eller halvtorra förhållanden.
Här kommer vi att visa den traditionella våta överföringsmetod. Börja med att ta bort
gelén från dess kassett
skära toppdelen innehållande brunnarna.
Notch det övre vänstra hörnet för att angivna gel orientering.
Flyt gelen i överföringsbuffert samtidigt förbereda överföringen smörgås.
För att göra överföringen smörgås
behöver du en kassett,
svamp, filterpapper
gelén
och ditt val av antingen PVDF eller nitrocellulous membran.
PVDF måste först aktiveras genom blötläggning av membranet i etanol för
två minuter. Men andra än detta PVDF eller val av nitrocellulous
membran är en personlig preferens.
Notch det övre vänstra hörnet för att indikera blot orientering
och inkubera membranen i överföringsbuffert under 10 minuter.
Skapa en stapel genom att placera de följande komponenter
från den svarta negativa katoden till röd positiv anod:
svamp,
filterpapper,
membran,
(Var noga med att inte vidröra gel eller membran med händerna och använd
ren pincett eller spatel istället.
Vidröra membranet under någon fas kan förorena blot och leda till
överdriven bakgrundssignal. ),
filterpapper
och svamp.
Använd en ren rulle med varje lager för att försiktigt rulla ut eventuella bubblor som kan vara
presentera
eftersom bubblor kommer att hämma en effektiv protein-överföring.
Lås kassetten och placera den i apparaten innehåller kylan
överföringsbuffert
säkerställa att kassetten är korrekt positionerad från negativ till positiv.
För att förhindra överhettning, är det fördelaktigt att överföra med en kall
packa i apparaten
apparat eller i ett kallt rum med spinnaren stången placeras på botten av kammaren.
Stäng kammaren och ansluta till en strömkälla.
Utför överföringen enligt tillverkarens anvisningar som är
normalt 100 volt 30-120 minuter.
Efter elektroöverföring av våra proteiner till ett membran, kommer vi
nu blockera blotten,
tillämpa en primär antikropp som är specifik för vår proteinet av intresse och sedan en sekundär
antikropp som känner igen den primära antikroppen.
Börja genom att avlägsna membranet från kassetten och sköljning tre gånger i vatten.
Som ett valfritt steg, kan vi verifiera proteinerna överfördes framgångsrikt
genom färgning av membranet med Ponceau röd.
Inkubera membranet i Ponceau under fem minuter och tvätta med vatten tills
banden är klara.
Efter kontroll
blotten kan sedan de-färgas genom att fortsätta att tvätta med vatten
eller TBS garn
tills färgämnet är helt avlägsnas.
Vi måste blockera alla områden av blotten som inte innehåller protein.
Detta kommer att förhindra icke-specifik bindning av antikroppen och minskar den totala
bakgrundssignal.
Vanliga blockerande buffertar inkluderar 5% icke-fet torrmjölk för analysen
i en TBS-lösning garn.
Men använd inte mjölk när sondering med fosfor specifika antikroppar
eftersom det kan orsaka hög bakgrund från sin endogena fosfoprotein, cesium.
Inkubera membranet med blockerande lösning under en timme vid rumstemperatur
temperatur
under lätt omröring.
Dekantera den blockerande lösningen och tvätta med TBS garn i fem minuter.
Vi är nu redo att lägga till vår antikropp. Späd den primära antikroppen i en
blockerande buffert vid en koncentration rekommenderas på databladet.
Inkubera över natten vid 4 grader Celsius med försiktig skakning.
En rekommenderad valfria steg är att också använda en positiv kontroll antikropp
vilket tillåter användaren att verifiera lika mängder totalt protein laddades i
varje brunn och medhjälpare vid felsökning genom att ta bort några
osäkerheter Western Blot förfarandet.
Nästa dag,
dekantera av den primära antikroppen och tvätta membranet med stora volymer
TBS garn och kraftig omrörning
fem gånger i fem minuter vardera.
Dessa stränga tvättar är extremt viktigt för att avlägsna icke-specifik
bakgrundssignaler.
Efter tvättning, späd den sekundära antikroppen i blockeringslösning och inkubera
membranet under en timme vid rumstemperatur vid en koncentration
rekommenderas på databladet.
I vårt exempel den sekundära också konjugeras till HRP för senare
detektion.
Dekantera membran och tvätta sekundärt med stora volymer TBS garn med
kraftig omrörning fem gånger i fem minuter vardera.
Du är nu redo för att upptäcka fasen.
I denna sista fas kommer vi att visa signaler utveckling med de vanligaste,
mest känsliga och mest billig detektionsmetod för elektrokemiluminiscens
(Eller ECL) reaktion.
Denna metod använder HRP enzymet,
som konjugerades till den sekundära att katalysera den ECL-reaktionen och producera
ljus.
En ljus sedan samlas på röntgenfilm och utvecklas
eller digitaliseras med hjälp av en specialiserad kamera tillräckligt känslig
för denna applikation.
Vi börjar genom att blanda lika delar ECL reagens i en ett-till-ett-förhållande
enligt tillverkarens instruktioner.
Vi kommer inkubera membranet under 3-5 minuter utan omröring.
Efter inkubation dekantera ECL blandning och använda ett laboratorium torka för att torka bort överflödig
lösning från hörnet av membranet.
Placera membranet i en klar plastfolie, såsom ett ark skydd för att förhindra
torkning. Undvik att låta membranet helt torka ut.
Vi kan nu använda en vals för att driva ut eventuella bubblor eller eventuellt överskott lösning.
Omedelbart utveckla membranet.
Både film och kamera system kan du manuellt justera exponeringen tid
För att säkerställa en perfekt bild Western Blöt.
Relativa band tätheter kan nu kvantifieras med kommersiellt tillgängliga
programvara.
. Korrekt molekylvikt kan också verifieras genom att jämföra bandet storlekar till
molekylvikt stege.