Tip:
Highlight text to annotate it
X
Med cellerna ströks föregående dag och odlades över natten, är vi redo
att börja med ICC förfarandet.
På denna första dag ICC, kommer vi fixa,
permeabilisering,
blot och lägga till en primär antikropp till cellerna.
Börja genom att aspirera odlingsmedium från varje brunn följt av fixering av
celler med 4% formaldehyd eller 10% formalin
under 10 minuter vid rumstemperatur.
Aspirera fixativ och skölj varje brunn två gånger med iskall PBS.
Var noga med att inte låta cellerna torka i detta
eller ytterligare steg i protokollet.
Om epitopen av din protein av intresse uttrycks intracellulärt,
cellulär permeabilisering är nödvändig för antikroppen att få tillgång till
cellen.
Även om det finns många olika permeabilisering agenter, den vanligaste
är 0,1 till 0,5% koncentration av Tween-20 eller
Triton-X100
utspädd i PBS.
Tween-20 används för epitoper belägna i cytoplasman
medan Triton-X100 används för permeabilisering kärnan och mitokondrier.
Inkubera brunnarna med permeabilisering buffert under 10 minuter vid rumstemperatur.
Aspirera permeabilisering buffert och tvätta tre gånger under 5 minuter
vardera med PBS garn.
PBS garn innehåller .1% Tween-20.
Vi kommer nu att blockera ospecifika bindningsställen med blockerande buffert under 1 timme
vid rumstemperatur.
Den bästa blockerande bufferten PBST innehållande 10% serum från
värdarter av din sekundär antikropp.
Emellertid kan 1% BSA i PBST också användas.
Förbered den primära antikroppen genom spädning i blockerande buffert vid den rekommenderade
utspädning som anges på databladet.
Flera hårdare spädningar är bra att redovisa variabler som
kan vara annorlunda i analysen och
för att uppnå bästa resultat.
Inkubera vid 4 grader Celsius över natten.
I vårt exempel, eftersom vi använder en okonjugerad primär vi kommer att använda en fluorofor
konjugerad sekundär dag två.