Tip:
Highlight text to annotate it
X
Efter elektroöverföring av våra proteiner till ett membran, kommer vi blockerar nu
blot,
tillämpa en primär antikropp som är specifik för vår proteinet av intresse och sedan en sekundär antikropp
vilket kommer att känna igen den primära antikroppen.
Börja genom att avlägsna membranet från kassetten och sköljning tre gånger i
vatten.
Som ett valfritt steg, kan vi verifiera proteinerna överfördes framgångsrikt
genom färgning av membranet med Ponceau röd.
Inkubera membranet i Ponceau under fem minuter och tvätta med vatten tills
banden är klara.
Efter kontroll blotten kan sedan de-färgas genom att fortsätta att tvätta med
vatten eller TBS garn tills färgen har försvunnit helt.
Vi måste blockera alla områden av blotten som inte redan innehåller protein.
Detta kommer att förhindra icke-specifik bindning av antikroppen och minskar den totala
bakgrundssignal.
Vanliga blockerande buffertar inkluderar 5% icke-fet torrmjölk för analysen
i en TBS-lösning garn.
Men använd inte mjölk när sondering med fosfor specifika antikroppar som kan
orsaka hög bakgrund från dess endogena fosfoprotein, cesium.
Inkubera membranet med blockerande lösning under en timme vid rumstemperatur
under lätt omröring.
Dekantera den blockerande lösningen och tvätta med TBS garn i fem minuter.
Vi är nu redo att lägga till vår antikropp. Späd den primära antikroppen i en
blockerande buffert vid en koncentration rekommenderas på databladet.
Inkubera över natten vid 4 grader Celsius med försiktig skakning.
En rekommenderad valfria steg är att också använda en positiv kontroll laddad antikropp
vilket tillåter användaren att verifiera lika mängder totalt protein laddades i varje
väl och medhjälpare i felsökning genom att ta bort eventuella oklarheter
med Western Blot proceduren. Nästa dag, dekantera av den primära antikroppen och
tvätta membranet med stora volymer TBS garn och kraftig omröring
fem gånger i fem minuter vardera.
Dessa stränga tvättar är extremt viktigt för att avlägsna icke-specifik
bakgrundssignaler.
Efter tvättning, späd den sekundära antikroppen i blockeringslösning och
inkubera membranet under en timme vid rumstemperatur vid en koncentration
rekommenderas på databladet.
I vårt exempel den sekundära också konjugeras till HRP för senare
detektion.
Dekantera membran och tvätta sekundärt med stora volymer TBS garn med
kraftig omrörning fem gånger i fem minuter vardera. Du är nu redo för
detektion fas.