Tip:
Highlight text to annotate it
X
Välkommen till Novus Visual Protocol serien.
I den här videon kommer vi att lära dig att utföra alla faser av en Western Blot använder
vanligaste metoderna för denna analys.
Innan vi kan börja förbereda blot måste vi först förbereda vårt urval lysat.
I det här exemplet kommer vi att förbereda ett protein lysat från odlade celler.
Här vi tvätta cellerna två gånger med iskall PBS och tillräckligt lysbuffert
att täcka cellerna.
Valet av lysbuffert beror till stor del på lokaliseringen
av din protein av intresse.
Vi skrapa cellerna och överför cellen lösningen på ett centrifugrör
placerades på is.
För att lösa membranbundna proteiner, kommer vi att kräva starkare
extraktion detergenter jämfört med isolerade cytoplasmatiska proteiner.
I det här exemplet använder vi en vanlig RIPA buffert, vilket är ett vanligt buffert
för att erhålla maximal proteinutbyte. Medan extrahera proteiner från alla
cellulära lokaliseringar,
är det mycket viktigt att inkludera proteashämmare i din lyseringsbuffert som kommer
förhindra nedbrytning av ditt prov. Använd alltid nyberedd proteas
hämmare, hålla prover på is och arbeta snabbt.
Vi löss cellerna genom att pipettera upp och ned
följt av inkubation på is under 30 minuter.
Centrifugera sedan cellerna till en pellet.
Kassera pelleten och samla upp supernatanten. Det här är din lysat.
Bestämma den totala proteinkoncentrationen i ditt prov lysat genom
testa en liten del av lysatet med ett kommersiellt tillgängligt protein
kvantifiering analys såsom BCA.
Detta kommer att hjälpa dig att ladda lika mängder protein i din gel.
Western blöts traditionellt förformade under reducerat och denaturerat
förhållanden.
Dessa villkor kommer att tillåta proteiner att vara åtskilda i deras molekylvikt
snarare än deras infödda konformations form eller laddning.
Att reducera och denaturera prover,
späd varje i en laddningsbuffert såsom traditionella Laemmli buffert.
Denna buffert innehåller beta-merkaptoetanol, eller DTT, för att minska disulfid
åsar mellan cysteiner,
SDS för att hjälpa denaturering en ger en negativ protein,
glycerol för att tillåta proverna att sjunka i varje brunn,
bromfenolblått att visualisera lysatet
och en ikon buffert.
Votex varje prov och inkubera vid 95 grader Celsius under fem minuter till
helt denaturera proteinerna. Du är nu redo att ladda dina prover till ett
SDS-PAGE-gel.