Tip:
Highlight text to annotate it
X
Välkommen till Novus visuella protokollet serien
I den här filmen får du lära dig hur du utför alla faser av fluorescerande
immunocytokemi
med de vanligaste metoderna för denna analys.
Innan du börjar ICC proceduren kommer vi att visa hur man förbereder
täckglas och cell plattor kultur följt av plätering av våra celler.
Vi börjar med syra behandla nya täckglas i en molar av saltsyra för
24 timmar.
Efter att noggrant dekantering av syran och ta bort täckglas,
Vi tvättar alla med destillerat vatten,
då en slutlig sköljning med etanol.
Som ett valfritt steg kan du placera täckglasen i en grundskikt rack
dränka den
en 0,1 mg / lösning gelatin eller polylysin
under fem minuter.
Dessa beläggningar medhjälpare att tillhandahålla ytterligare vidhäftning av celler till
täckglas
säkerställa att de inte lossnar under senare tvättsteg.
Efter behandling bort grundskikt rack och torka täckglasen i kulturen
huva eller en uppvärmd ugn.
Rena torra täckglasen införes därefter i varje brunn i en sex väl
odlingsplatta
och täcktes med ett lock.
För att spara tid kan stora volymer av plattor beredas i förväg för senare användning.
Plattorna kan också steriliseras genom att placera dem under huven UV ljus.
Med rena täckglas framställda i sex brunnar,
Vi kan nu lägga våra celler.
Platted här i celler lägger en densitet av en halv miljon celler per brunn.
Celler odlas sedan över natten i inkubator eller tills de når önskad
densitet.
Med cellerna ströks föregående dag och odlades över natten, är vi redo
att börja med ICC förfarandet.
På denna första dag ICC, kommer vi fixa,
permeabilisering,
blot och lägga till en primär antikropp till cellerna.
Börja genom att aspirera odlingsmedium från varje brunn följt av fixering av
celler med 4% formaldehyd eller 10% formalin
under 10 minuter vid rumstemperatur.
Aspirera fixativ och skölj varje brunn två gånger med iskall PBS.
Var noga med att inte låta cellerna torka i detta
eller ytterligare steg i protokollet.
Om epitopen av din protein av intresse uttrycks intracellulärt,
cellulär permeabilisering är nödvändig för antikroppen att få tillgång till
cellen.
Även om det finns många olika
permeabilisering agenter, de vanligaste är 0,1 till 0,5%
koncentration
Tween-20
eller Triton-X100
utspädd i PBS.
Tween-20 används för epitoper belägna i cytoplasman
medan Triton-X100 används för permeabilisering kärnan och mitokondrier.
Inkubera brunnarna med permeabilisering buffert under 10 minuter vid rumstemperatur.
Aspirera permeabilisering buffert och tvätta tre gånger under 5 minuter vardera med
PBS garn.
PBS garn innehåller .1% Tween-20.
Vi kommer nu att blockera ospecifika bindningsställen med blockerande buffert under 1 timme
vid rumstemperatur.
Det bästa blockerande buffert är PBST innehållande 10% serum från värden
arter av din sekundär antikropp.
Emellertid
1% BSA i PBST kan också användas.
Förbered den primära antikroppen genom spädning i blockeringsbuffert
vid rekommenderad spädning anges av databladet.
Flera hårdare spädningar är bra att ta hänsyn till variabler som kan vara
annorlunda i din analys
och för att uppnå bästa resultat.
Inkubera vid 4 grader Celsius över natten.
I vårt exempel,
eftersom vi använder en okonjugerad primär vi kommer att använda en fluorofor
konjugerad sekundär dag två.
I dag två av vår ICC förfarande
Vi kommer att lägga vår sekundär antikropp,
utföra en valfri dubbel märkning och nukleär märkning steg,
montera våra täckglasen till bilder,
och få bilder på våra antikroppar med ett fluorescerande mikroskop.
Först vi aspirera ut primära antikroppar lösning följt av tvättning av cellen
tre gånger med PBST under fem minuter vardera.
Nästa förbereda floraform konjugerad sekundär antikropp som kommer att binda till den primära
antikropp.
Späd den sekundära blockeringsbuffert
med rekommenderar utspädning som anges på databladet
och inkuberas rumstemperatur under en timme.
Täcker plattorna med folie förhindrar känsliga färgämnen från förnedrande.
Aspirera av den sekundära antikroppen följt av tvättning av cellerna
tre gånger med PBST
under fem minuter vardera.
Som ett valfritt steg en andra primär och sekundär par kan användas
att visualisera en andra epitop
genom att använda en annan våning för det.
Dessutom, DNA-bindande färgämnen såsom DAPI
kan appliceras utan behov av sekundära antikroppar.
Se hela skriftlig Novus protokoll för ytterligare information om hur du dubbla och
trippel etikett.
Täckglas är nu redo att monteras på objektglas.
Ta en ren bild och fördela en droppe antifad monteringsmedium genom att långsamt
uppringning ner kolven av pipetten.
Ta försiktigt bort ett täckglas från brunnen,
att överskottet tvätt att rinna av
och placera cellerna nedåt på bilden.
Klar nagellack kan användas för att täta täckglas och hindra den från
uttorkning.
Objektglas kan nu visualiseras under ett mikroskop
eller lagras vid -20 eller 4 grader Celsius
i en mörk bild låda eller glida bok.
Begränsa mängden tid varje bild exponeras för mikroskop ljus kommer medhjälpare i
förlänga den fluorescerande signalen
och kommer att förhindra fotoblekning.